空斑形成细胞测定（琼脂固相法）检测

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空斑形成细胞测定（琼脂固相法）检测概述

空斑形成细胞测定（Plaque Forming Cell Assay, PFC）是免疫学研究中用于评估B淋巴细胞功能和体液免疫应答的重要技术。琼脂固相法作为经典的空斑形成细胞检测方法，通过将淋巴细胞与抗原致敏的红细胞（如绵羊红细胞）混合后包埋在琼脂凝胶中，利用补体介导的溶血反应形成可见的空斑，从而量化抗体分泌细胞的数量。该方法广泛应用于疫苗研发、免疫调节剂筛选、疾病模型研究及免疫功能评价等领域，具有灵敏度高、结果直观、重复性好等优势。

检测项目

琼脂固相法主要检测以下核心项目：
1. 抗体分泌细胞数量：通过空斑计数反映特异性B细胞的活性与增殖能力；
2. 体液免疫应答强度：评估抗原刺激后免疫系统的反应水平；
3. 抗体类型分析：通过调整补体来源或检测条件，区分IgM或IgG类抗体的分泌情况；
4. 细胞功能验证：用于杂交瘤细胞株筛选或免疫治疗细胞产品的效价测定。

检测仪器

实验需配备以下关键仪器设备：
- CO₂培养箱：维持37℃、5% CO₂的细胞培养环境；
- 倒置显微镜：用于空斑观察与计数；
- 离心机：处理细胞悬液与分离淋巴细胞；
- 酶标仪（可选）：定量检测溶血释放的血红蛋白；
- 细胞计数仪：精确计算细胞浓度。

检测方法

标准操作流程分为以下步骤：
1. 样本制备：从小鼠脾脏或外周血中分离淋巴细胞，密度梯度离心法纯化；
2. 琼脂糖凝胶制备：将0.5%琼脂糖与细胞悬液混合，铺于培养皿形成固相基质；
3. 补体添加：加入豚鼠补体溶液，37℃孵育1-2小时诱导溶血反应；
4. 空斑观察：显微镜下计数透明溶血斑，每个空斑代表一个抗体分泌细胞；
5. 数据分析：按公式PFC/10⁶ cells计算单位细胞活性。

检测标准

实验需遵循以下标准规范：
- 标准：参照WHO《疫苗临床前评价指南》中免疫原性检测要求；
- 行业标准：执行《中国药典》细胞免疫检测相关章节规定；
- 质量控制：空斑直径需≥0.1mm，阴性对照空斑数应＜5个/10⁶细胞；
- 方法验证：批内变异系数（CV）≤15%，批间CV≤20%。

注意事项

确保检测准确性的关键控制点包括：
- 补体需新鲜配制并预冷保存，避免反复冻融；
- 琼脂糖浓度严格控制在0.5%-0.7%，保证凝胶通透性；
- 细胞接种密度需优化，过高会导致空斑重叠；
- 需设置空白对照（无补体）和阴性对照（未免疫动物样本）。